Forskere har store forhåbninger til CRISPR / Cas9-teknologien, som muliggør ændringer med høj præcision i genomerne hos levende organismer, inklusive mennesker. Alle nye videnskabelige artikler offentliggøres, der beskriver forskellige typer CRISPR-systemer såvel som deres ændringer. "Lenta.ru" taler om opdagelserne i dette område, lavet i 2016.
Tusinder af dem
CRISPR / Cas9 er et bakterielt adaptivt immunitetssystem, der giver mikroorganismer mulighed for at bekæmpe vira. Den består af afstandsstykker - DNA-sektioner svarende til visse fragmenter (protospacere) af det infektiøse agents DNA. Afstandsstykkerne koder for specifikke crRNA-molekyler, der binder til Cas9-enzymet. Det resulterende kompleks binder sig til virusets DNA-kæde, og Cas9 fungerer som et saks og skærer det.
Faktisk er CRISPR / Cas9 kun et af mange lignende systemer, som bakterier og arkæer har. Forskere deler dem i to klasser. Den første klasse inkluderer CRISPR-systemer af type I, III og IV, og den anden - II og V. Type II indeholder Cas9-proteinet involveret i erhvervelsen af nye afstandsstykker, ophobning af crRNA i cellen og DNA-spaltning. I andre systemer anvendes multiproteinkomplekser til disse formål. Dette gør type II til den enkleste type CRISPR-system, der er egnet til gentekniske behov.
Typer kan igen opdeles i undertyper afhængigt af hvilke yderligere gener der er forbundet med CRISPR. For eksempel indeholder IIA-systemer csn2-genet, som koder for et protein, der binder til DNA og er involveret i erhvervelsen af afstandsstykker. I IIB-systemer er csn2 fraværende, men der er et cas4-gen, hvis funktion stadig er ukendt, og IIC-systemer har hverken csn2 eller cas4.
Skatte inde i bakterier
Salgsfremmende video:
Alle kendte CRISPR-systemer er blevet opdaget af forskere i bakterier, der dyrkes under laboratorieforhold. Der er dog et stort antal ukultiverede mikroorganismer, som inkluderer både arkæer og bakterier. De lever normalt under ekstreme forhold - mineralkilder eller giftige vandområder i forladte miner. Forskere kan dog isolere DNA fra dem og identificere specifikke regioner i det. I et nyt papir, der blev offentliggjort i Nature den 22. december, afkodede genetikere ved University of California, Berkeley genomer fra naturlige mikrobielle samfund og opdagede andre variationer af CRISPR-systemet.
Bakteriofag - en virus, der inficerer bakterier
Billede: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Forskere formåede at finde ud af, at nogle typer lidt studerede arke-lignende nanoorganismer ARMAN også har CRISPR / Cas9, selvom man tidligere troede, at kun bakterier har dem. Det blev bemærket, at dette system indtager en mellemposition mellem undertyper IIC og IIB og kan tjene som et forsvar mod parasitære "springende" gener (transposoner), der kommer ind i mikroorganismen fra andre arkæer. Et forsøg på at reproducere aktiviteten af archaeal CRISPR / Cas9 i E. coli (Escherichia coli) førte ikke til noget, hvilket indikerer eksistensen af nogle yderligere specifikke mekanismer, der regulerer systemet.
Nye typer systemer inden for anden klasse, CRISPR / CasX og CRISPR / CasY, blev også isoleret fra bakterier, der lever i grundvand og sedimenter. CRISPR / CasX-systemet inkluderer proteinerne Cas1, Cas2, Cas4 og CasX. Sidstnævnte, som vist ved eksperimenter med E. coli, skelnes ved nukleaseaktivitet, det vil sige, at den er i stand til at spalte fremmed DNA som Cas9. Dette sker dog kun, hvis TTCN-sekvensen er foran protospacere, hvor N er en af de fire nukleotider. Sådanne sekvenser kaldes PAM (protospacer tilstødende motiv - motiv ved siden af protospacer). CRISPR / Cas9-systemet har også sin egen PAM - NGG, som skal placeres efter protospaceren. Derudover er CRISPR / CasY i stand til at skære DNA, hvis der er en TA PAM-sekvens nær målstedet.
Hvad er løftet om denne opdagelse? Faktum er, at de opdagede systemer er de mest kompakte, der kendes i øjeblikket. Ifølge forskere gør den lille mængde proteiner, der kræves til deres arbejde, CRISPR / CasX og CRISPR / CasY til praktiske værktøjer til DNA-redigering. Desuden vil metagenomisk forskning, hvor DNA opnået fra miljøet undersøges, afsløre andre typer CRISPR-systemer, der er nyttige til genteknologi.
Vejen til ekspertise
Der er naturligvis et alternativ til søgningen efter CRISPR-systemer i naturen - forbedring af den allerede eksisterende CRISPR / Cas9-teknologi. På trods af sin høje nøjagtighed laver hun fejl ved at skære DNA på det forkerte sted. Dette gør det vanskeligt at foretage de korrekte ændringer i generne og derfor effektivt behandle arvelige sygdomme. Derfor leder forskere efter måder at forbedre systemets ydeevne. I 2016 har der været mange videnskabelige artikler afsat til at ændre CRISPR og gøre det til forskellige genværktøjer.
Protein Cas9 og crRNA - hovedkomponenterne i CRISPR-systemet
Billede: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Så den 8. december offentliggjorde tidsskriftet Cell en artikel af forskere fra University of Toronto, der skabte "anti-CRISPR" - et system, der slukker for mekanismen under visse betingelser. Dette gør det muligt at undertrykke Cas9-aktivitet, hvis guide-RNA'et binder til det forkerte fragment og forhindrer fejl. Anti-CRISPR består af tre nukleasehæmmende proteiner. Naturligvis blev det oprindeligt ikke opfundet af forskere, men af vira, som således neutraliserede bakteriens immunitet.
I juni bekræftede amerikanske forskere sammen med kolleger fra Rusland, at CRISPR / C2c2-systemet, opnået fra fusobacterium Leptotrichia shahii, er i stand til at skære enkeltstrenget RNA. Som et resultat kan CRISPR-systemet bruges til at slå ud - undertrykke funktioner - af messenger-RNA, som bærer information fra gener til ribosomer, hvor proteiner syntetiseres på basis af det.
I maj oprettede forskere ved University of California CRISPR-EZ, en teknologi der gør det muligt at indsætte nye DNA-molekyler i genomerne hos musembryoner med næsten 100% succes. CRISPR / Cas9-systemet introduceres i befrugtede dyreæg ved hjælp af en mikroskopisk nål og en lille elektrisk afladning. I deres eksperiment lykkedes det forskere at indføre en mutation i genet hos 88 procent af musene. Dette overstiger antallet af genetisk modificerede mus produceret ved CRISPR-redigering, der bruger konventionelle injektioner.
I april, ved hjælp af en mutant variant af Cas9, der mangler nukleaseaktivitet, udviklede molekylærbiologer ved University of Massachusetts School of Medicine CRISPRainbow-teknologien. Vejlednings-RNA'et, som angiver, hvor enzymerne binder sig til, indeholdt fluorescerende mærker, hvilket f.eks. Gør det muligt at spore bevægelsen af mobile genetiske elementer.
Anopheles-myg kan være det første offer for CRISPR-systemer
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Fagre nye verden
Forskere bruger allerede CRISPR-systemer til at skabe genetisk modificerede organismer, såsom malariamyggen, der spreder skadelige gener blandt deres vilde slægtninge. Denne metode kaldes gendrev. Hvis en af forældrene til et individ var bærer af et mutantgen, vil han give det til sit afkom med en sandsynlighed på 50 procent. Dette skyldes, at forældrene har to kopier af genet, og kun en af dem er defekt. CRISPR er i stand til at kopiere et mutantfragment og indsætte det i et sundt gen. Som et resultat får afkomene en mutation med 100% sandsynlighed.
I 2016 godkendte eksperter fra det rekombinante DNA-rådgivende udvalg (RAC) en ansøgning fra University of Pennsylvania om at udføre tests på human genetisk modifikation ved hjælp af CRISPR / Cas9-teknologi.
Imidlertid blev de overhalet af kineserne. I november rapporterede tidsskriftet Nature, at kinesiske forskere for første gang introducerede celler med gener modificeret af CRISPR / Cas9-systemet til mennesker. Forskerne ekstraherede immunceller (T-lymfocytter) fra blodet fra en patient med metastatisk lungekræft og brugte derefter CRISPR-teknologi til at slukke for genet, der koder for PD-1-proteinet. Sidstnævnte har vist sig at undertrykke immunitet ved at fremme tumorvækst. Forskere dyrkede de redigerede celler, øgede antallet og injicerede dem derefter tilbage i menneskekroppen. Om genterapi vil klare sygdommen, skal stadig ses.
CRISPR-systemer kan også bruges til at bekæmpe hiv og arvelige sygdomme hos mennesker. Imidlertid kræves yderligere forskning for at udvikle effektive behandlinger. Naturligvis taler vi ikke om mutanter, som i science fiction-film, men forskere vil hurtigt kunne skabe genetisk modificerede organismer, for eksempel landbrugsplanter med resistens over for parasitter. Det er stadig at se, hvorfor forskerne, der opdagede CRISPR og fandt ud af, hvordan det kunne bruges, endnu ikke har vundet Nobelprisen.
Alexander Enikeev