Genteknologi åbner muligheder for menneskeheden til at skabe tidligere ikke-eksisterende organismer og ødelæggelse af genetiske sygdomme. Ting er dog ikke så rosenrøde, da selv den gennembrudte CRISPR / Cas9-teknologi er langt fra perfekt. De fejl, hun laver, kan være sjældne, men man er nok til at blive fatalt for en person. Lenta.ru taler om, hvad der er galt med CRISPR, og hvordan forskere forsøger at løse situationen.
CRISPR / Cas9-systemet - en slags DNA-saks - betragtes med rette som en revolution inden for genteknologi. Med sin hjælp kan forskere redigere det menneskelige genom, fjerne skadelige mutationer fra det og dermed behandle ubehagelige og dødbringende arvelige sygdomme. Man skulle dog ikke tro, at der ikke var sådanne metoder før. I arsenal af genetikere var for eksempel nukleaser indeholdende zink "fingre" og endonukleaser - enzymer, der bryder DNA-molekyler på bestemte steder. Med hensyn til nøjagtighed, alsidighed og omkostninger er de mærkbart ringere end CRISPR / Cas9, selvom sidstnævnte langt fra er perfekt.
CRISPR / Cas9 blev oprindeligt skabt ikke af forskere, men af naturen. Det er en molekylær mekanisme, der findes i bakterier og giver dem mulighed for at bekæmpe bakteriofager og andre parasitter. Faktisk fungerer det som en immunitet mod infektion. CRISPR (står for "korte palindromiske gentagelser, jævnligt fordelt i grupper") er specielle regioner (loci) af DNA. De indeholder korte fragmenter af DNA-vira, der engang inficerede forfædrene til nutidens bakterier, men blev besejret af deres indre forsvar. Disse stykker kaldes afstandsstykker og adskilles fra hinanden ved gentagne sekvenser.
Når en bakteriofag invaderer en bakterie, anvendes hver gentagne sekvens og dens tilstødende afstandsstykke som en skabelon til syntese af molekyler kaldet crRNA'er. Der dannes mange forskellige RNA-kæder, de binder sig til Cas9-proteinet, hvis opgave er ekstremt enkel: at skære virusets DNA. Imidlertid vil han kun være i stand til at gøre dette, efter at crRNA finder et komplementært fragment af viralt DNA. Efter at Cas9 bryder den fremmede nukleinsyre fra hinanden, ødelægges den sidstnævnte fuldstændigt af andre nukleaser.
CRISPR / Cas9 er god netop for sin nøjagtighed, for for bakterier er immunsystemets korrekte funktion et spørgsmål om liv og død. "Anti-virus" -systemet skal finde en del af viralt DNA blandt en million andre og vigtigst af alt ikke at forveksle det med sit eget genom. I løbet af millioner af års udvikling har bakterier perfektioneret denne mekanisme. Så lige efter at de havde fundet ud af, hvorfor et CRISPR-system var nødvendigt, indså de, at det kunne tæmmes som et hidtil uset nøjagtigt genredigeringsværktøj.
For at erstatte en bestemt region i genomet med en anden er det nødvendigt at syntetisere guide-RNA, som i princippet svarer til crRNA. Hun fortæller Cas9, hvor det er nødvendigt at lave et dobbeltstrenget brud i den modificerede organisms DNA. Vi behøver imidlertid ikke at ødelægge genet, men ændre det - for eksempel erstatte et eller flere nukleotider og fjerne den skadelige mutation. Her kommer naturen til undsætning igen. Naturlige reparationsmekanismer begynder straks at genoprette skåret kæde. Tricket er, at til dette fjernes nogle RNA-fragmenter nær pausen, hvorefter lignende sekvenser indsættes der. Forskere kan erstatte dem med deres egne DNA-sekvenser og således ændre genomet.
Skematisk gengivelse af CRISPR
Salgsfremmende video:
Billede: Kaidor / Wikipedia
Intet er dog perfekt. På trods af sin relative nøjagtighed laver CRISPR nogle gange fejl. En af grundene ligger i selve systemets natur. Det er ufordelagtigt for bakterier, at crRNA falder sammen med 100 procent med et fragment af viralt DNA, som kan variere med et eller to nukleotider. Det er bedre for hende, at nogle nukleotider kan være forskellige, hvilket giver mikroorganismen en bedre chance for at bekæmpe infektionen. Samtidig truer lav specificitet inden for genteknologi med fejl: ændringer kan foretages på det forkerte sted. Hvis dette sker under forsøg på mus, er der ingen særlig tragedie, men redigering af det menneskelige genom kan blive en katastrofe.
Dette forklarer de vestlige forskeres bekymring over de eksperimenter, der udføres i Kina. Asiatiske forskere har brugt CRISPR-teknologi til genetisk modifikation af menneskelige embryoner. Sådanne eksperimenter er blevet forbudt i Europa og USA, men for nylig har Storbritannien tilladt dem - udelukkende til forskningsformål. Sådanne embryoner bliver nødt til at blive ødelagt om et par uger efter modtagelsen, hvilket udelukker "opdræt" af GM-mennesker.
CRISPR / Cas9 ville dog ikke være så fantastisk, hvis det ikke kunne forbedres. Så lærte forskere Cas9 at skære ikke to kæder på én gang, men kun en. Klippet foretages to forskellige steder i DNA-sekvensen på forskellige tråde, så systemet skal kunne genkende dobbelt så mange nukleotider som normalt, hvilket gør det mere nøjagtigt.
Protein Cas og crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Forskere ved University of Western Ontario har fundet en anden måde at forbedre denne teknologi på. De forsøgte at løse problemet med reparation af det udskårne DNA. Den hurtige gendannelse af nukleinsyrekæden fører til, at forskere ikke har tid til at foretage deres egne korrektioner til genomet. Således oprettes en ond cirkel: kæden, der repareres på en uønsket måde, skal skæres igen med Cas9-proteinet.
For at forhindre dette i at modificere forskerne proteinsaksen for at skabe TevCas9-proteinet. Det skærer DNA-strengen to steder, hvilket gør det vanskeligt at reparere stedet. Til syntesen af et nyt enzym blev enzymet I-Tevl tilsat til Cas 9, som også er en endonuklease, det vil sige et protein, der spalter et DNA-molekyle i midten snarere end at spalte enderne af sekvensen, som exonukleaser gør. Det resulterende fusionsprotein viste sig at være mere præcist ved binding til specifikke steder og mindre sandsynligt at begå en fejl og skære det forkerte sted.
Krystalstruktur af Cas9 bundet til DNA
Foto: Cas9 wiki-projekt / Wikipedia
Der er en anden måde at forbedre nøjagtigheden af CRISPR-systemer på. "Våbenkappet" mellem bakterier og vira har ikke kun ført til udviklingen af forsvarssystemer i mikroorganismer, men også til måder at neutralisere dem på. Således muterer bakteriofager hurtigt og mister de områder, hvor bakteriel immunitet genkender dem. Der er dog noget kode for anti-CRISPR proteiner, der forstyrrer arbejdet i crRNA-Cas9-komplekset.
Den 8. december offentliggjorde tidsskriftet Cell en artikel af forskere fra University of Toronto, der skabte "anti-CRISPR" - et system, der giver dig mulighed for at slukke for mekanismen under visse betingelser. Det forhindrer uønskede fejl ved at undertrykke Cas9-aktivitet i tilfælde af, at guide-RNA'et binder til det forkerte fragment. Anti-CRISPR består af tre proteiner, der hæmmer nuklease og kodes af generne fra en af de bakterielle vira.
CRISPR-teknologi anvendes allerede til behandling af alvorlige sygdomme som leukæmi og lungekræft og testes også for at fjerne HIV fra immunceller. Da forskere finder nye måder at forbedre denne metode på, åbnes flere og flere muligheder for dens anvendelse.
Alexander Enikeev