Prøver af mumies væv under navnene "Maria" og "Vavita" blev sendt fra Peru til et russisk laboratorium til undersøgelse. De tilvejebragte prøver af biologisk væv blev undersøgt ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi, Raman-spektre, ICPE, og sammensætningen af diatoméjord (et stof på overfladen af huden hos mumier) blev undersøgt. En undersøgelse af DNA fra det overførte væv blev også udført.
Prøveforberedelse
Vævsprøver på 500 ug blev overført til plastrør og opløst i 1 ml puffer (10 mM Tris-HCI pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Til de resulterende suspensioner blev Na-dodecylsulfat tilsat til 0,5%, opvarmet til +80 ° C, og efter 10 minutter blev proteinase K (op til 500 ug / ml) anbragt i en termostat (+55 ° C) i 24 timer.
Deproteinisering blev udført ved den phenoliske metode: tilsætning af phenol i samme volumen til suspensionen, derefter phenol: chloroform (1: 1), chloroform; efter hver tilsætning blev konstant omrøring udført på en vinkelrotor og centrifugering ved 15.000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter.
Til det supersediment, der blev opnået efter den 3. centrifugering, blev der tilsat 1/10 del af volumenet af 1 M NaCl og 2,5 volumener af to gange destilleret ethylalkohol og efterlod natten over ved -30 ° C i koniske prøverør - "Eppendorf". Centrifugering blev udført ved 15 tusinde vol. min. inden for 10 minutter og modtog DNA "præcipiteret" i form af et brunt bundfald. DNA-pelleten blev vasket to gange med 70% ethylalkohol og tørret ved stuetemperatur (1 time) og derefter opløst i TE-puffer.
PCR blev udført på en programmerbar termisk cycler "My Cycler" ("Bio = Rad") under anvendelse af standard oligoprimere syntetiseret ved fastfasemetoden ved foreningen "Beagler" (Skt. Petersborg). Reaktionsblandingen til amplifikation med et volumen på 25 μL inkluderede: 15 nM af hver oligoprimer, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 ved +25 ° C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 mercaptoethanol, 170 μg / ml BSA og en blanding af fire basiske dNTP'er i en koncentration på 1,0 mM hver og termostabil DNA-polymerase Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Efter denaturering (10 minutter, 94 ° C) blev der udført 35 amplificeringscyklusser for hvert testsystem: 94 ° C - 1 minut, 58 ° C - 1 minut, 72 ° C - 1 min. For at kontrollere specificiteten blev DNA-prøver med kendte genotyper til de studerede loci (markørsystemer) såvel som kontrolprøver indført i reaktionen.indeholdende en blanding af reagenser uden DNA. Efter amplifikation blev der tilsat en farvningsbuffer til portioner af reaktionsblandingen (7 ul) og adskilt ved lodret elektroforese i 6% polyacrylamidgel (210x150x1 mm), farvet med ethidiumbromid og fotograferet under ultraviolet lys. For at identificere alleler blev der anvendt alleliske standarder svarende til disse loci ("stiger").
Salgsfremmende video:
DNA-analyse
Til undersøgelsen anvendte vi metoden til exome-analyse af humant DNA baseret på sekvensering med høj kapacitet med berigelse ved hybridisering.
Teknik til exome-analyse af humant DNA.
2 prøver blev analyseret … Alle trin i prøveforberedelse før PCR blev udført i rene rum. Prøvepræparation, DNA-ekstraktion og amplificering af individuelle DNA-fragmenter blev udført i forskellige rum.
Specifikke adaptere (KAPA Library Preparation Kit og SeqCap Adapter Kit; Roche) blev ligeret til enderne af det genomiske fragmenterede DNA (~ 5 ng), hvorefter en to-trins udvælgelse af fragmenter i længdeområdet 200-350 bp blev udført under anvendelse af AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … De resulterende fragmenter blev amplificeret med adapter-specifikke primere og hybridiseret med biotinylerede specifikke prober (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) i 28 timer ved 47 ° C. I en reaktion blev to DNA-prøver kombineret. Biotinylerede probe-DNA-hybrider blev isoleret og oprenset med streptovidin-konjugerede magnetiske partikler; en anden amplifikation og kvalitativ vurdering af det resulterende DNA-bibliotek blev udført (TapeStation 4200; Agilent Technologies). For at fjerne off-target amplificeringsfragmenter og adapterdimerer blev DNA-biblioteket genoprenset under anvendelse af AMPureXP Beads magnetiske partikler (fig. 1). Den endelige koncentration af det forberedte bibliotek blev vurderet på et Quantus-instrument under anvendelse af et kommercielt QuantiFluor® dsDNA-systemkit (Promega). Det resulterende DNA-bibliotek blev immobiliseret på overfladen af strømningscellen. Sekventering blev udført på Illumina-platformen ved anvendelse af en standardflowcelle og MiSeq-reagenssæt v2 300 (2 × 150 cyklusser). Det resulterende DNA-bibliotek blev immobiliseret på overfladen af strømningscellen. Sekventering blev udført på Illumina-platformen ved anvendelse af en standardflowcelle og MiSeq-reagenssæt v2 300 (2 × 150 cyklusser). Det resulterende DNA-bibliotek blev immobiliseret på overfladen af strømningscellen. Sekventering blev udført på Illumina-platformen ved anvendelse af en standardflowcelle og MiSeq-reagenssæt v2 300 (2 × 150 cyklusser).
Figur: 1
Generel vurdering af kvaliteten af sekventeret DNA
Standardmetoder som FastQC og Jellyfish og KraTER-programmerne blev anvendt til den indledende kvalitetsvurdering. Kvalitetsvurderingen viste ingen kvalitetsproblemer med den sekventerede DNA-aflæsning for begge prøver. Billeder vises ikke, da de ikke er informative.
For den første prøve (yderligere M, stor mumie "Maria") blev 113,4 M-læsninger sekventeret, for den anden prøve (yderligere W, lille mumie "WaWita") blev sekvenser på 22,9M læst.
Det næste trin var at rense de sekventerede læser fra forskellige tekniske sekvenser, der ville forstyrre den videre analyse. Til dette blev Cookiecutter-programmet brugt. Efter rengøring var der 113,3 M (99%) læsninger og 22,8M (99%) læsninger for M og W.
Estimering af mængden af antikt DNA og dets adskillelse fra moderne
Standardmetoden til vurdering af tilstedeværelsen og mængden af gammelt DNA er at estimere mængden af tidsskadede nukleotider. Til dette blev MapDamage 2.0-programmet brugt. MapDamage 2.0, som viste mængden af gammelt DNA i 30,1%, men da MapDamage indebærer, at vi bruger en tæt henvisning, og vi ved ikke nøjagtigt, hvor tæt begge prøver er genomet til moderne mennesker, og vi brugte et exome-bibliotek, var denne metode i sig selv ikke tilstrækkelig. En anden god metode til vurdering af gammelt DNA er antallet af korte fragmenter.
Filtrering af det påståede gamle DNA fandt sted i tre faser. På det første trin fjernede vi alle sammenkoblede læsninger, der ikke kan krydses og samles til en uparret læse med en overlapning. Disse læsninger indikerede, at det originale fragment, der blev sekventeret, var længere end 300 bp. og mest sandsynligt moderne DNA. Så efter dette trin forblev henholdsvis 86,9% og 91,8%. Derefter blev enkelte overlappede fragmenter valgt, så deres længde var kortere end 150 bp, da dette er den længde, vi forventede for antikt DNA. Efter dette trin forblev henholdsvis 8,6% og 38,5% for prøver M og W. Det skal bemærkes, at trods forskellen i procent er det absolutte antal aflæsninger mellem prøver M og W meget ens: 9,8M og 8,8M, hvilket kan forklares ved, at indholdet af gammelt DNA i begge prøver er ens.
| Parameter | Prøve M (Maria) | Prøve W (Wawita) |
| Antal læsninger | 113.3M | 22,8 mio |
| Procentdel af korte fragmenter <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Procentdel af korte fragmenter <150 bp (antal) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Procentdel af fragmenter justeret pr. Humant genom (antal) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2.264.551) |
| Procentdel af fragmenter justeret pr. Humant genom fra kort <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Opnåelse af DNA svarende til det humane referencegenom
Det resulterende antagelige antikke DNA blev kortlagt til et referencenoment genom ved anvendelse af en standard genomisk variant-søgeledning under anvendelse af BWA, samtools og Wcftools.
Desuden blev kun 23,8% af prøven M og 25,6% med succes kortlagt til referencesgenomet for moderne mennesker. For begge prøver kunne 75% af de sekventerede læser ikke kortlægges på det humane genom. Dette kan forklares både ved kontaminering og ved det faktum, at disse prøver er placeret langt nok fra genomet til moderne mennesker. På samme tid er det værd at huske på, at vi har sekventeret exome-biblioteket og derved minimeret forureningen af bakterie-DNA.
Indledende rekognoseringsanalyse af ikke-kogte læsninger viste, at nogle af dem tilhørte gentagne DNA-specifikke for hovdyr, dette kan forklares med det faktum, at lama-fedt blev brugt til mumificering.
For en mere detaljeret analyse tager det cirka tre ugers beregninger, da de eksisterende løsninger kun blev lavet til virale og bakterielle genomer, og vi er nødt til at sammenligne med alle eksisterende genomer, inklusive plantegenomer, for at forstå, hvilke arter der blev sekventeret.
Karakteristika for de fundne indstillinger
De kortlagte aflæsninger blev brugt til at søge efter varianter, der adskiller M- og W-prøver fra det moderne humane genom, samt til at vurdere forurening af læser fra det humane Y-kromosom.
Det første spørgsmål, der skulle besvares, var hvilke kromosomer de sekventerede læser blev kortlagt til.
Da vi ved, at Marias prøver blev isoleret fra knogler og muskler, og Vavita kun var fra knogler, forventede vi en forskel i mængden af mtDNA. Men der var ikke meget forskel.
Antallet af kortlagte læst på Y er en anden test for kontaminering af moderne mennesker. Interessant nok viste det sig at være det samme i begge prøver.
Statistikken for de fundne varianter er vist nedenfor:
| Parametre | Prøve M (Maria) | Prøve W (Wawita) |
| Antal fundne indstillinger | 79.957 | 48.941 |
| Antal indstillinger på Y | 534 | 541 |
| Antallet af pålidelige muligheder (mere end 20 læsninger og mere end 30 kvalitet) | 16969 | 6181 |
| Varianter med kendt rsid (tilgængelig i snip-databasen) | 5701 | 3089 |
| Generelle gyldige indstillinger | 92 | |
| almindelige indstillinger med rsid | 49 |
Derefter blev det muligt at besvare spørgsmålet: er M og W pårørende? Svaret er nej.
Kun 49 matchende varianter blev fundet mellem M og W og 3040 adskilt for varianter med kendt rsid. Desuden er det måske forskellige typer eller underarter af en person eller en ukendt væsen.
Interessant nok er varianterne med Y-kromosomet identiske for begge prøver, hvilket indikerer kontaminering af den samme person, og at der i det gamle DNA fra Y-kromosomet sandsynligvis stadig ikke er noget kromosom.
Evaluering af ligheden med de eksisterende sekventerede humane genomer fra 1000 Human Genome Project
Bemærk, at dette kun er en omtrentlig analyse, da der for en mere nøjagtig analyse er behov for varianter fra regioner i genomet under neutral selektion, og vi har exomedata.
Ikke desto mindre var det ved anvendelse af 5708 varianter til M eller 3096 til S muligt at udføre en variant af analysen sammenlignet med dataene fra 1000 humane genomer.
Resultatet af PCA-analysen på billedet herunder er en overlejring af to billeder for M og W, beregnet separat, da der er for få almindelige muligheder mellem M og W til at estimere afstanden mellem M og W.
Lighed score.
Som du kan se, er der ingen sammenfald med nogen gruppe af gener, de adskiller sig også fra hinanden. Men det skal huskes, at vi brugte kodningssekvenser under udvælgelse, og det anbefales at bruge varianter under neutralt valg.
Ikke desto mindre er PCA-resultatet i god overensstemmelse med manuel verifikation af varianter, hvilket viste, at dataene er i en urefereret homozygote, hvilket igen viser, at billederne er langt fra det moderne menneskelige genom.
Konklusion
Desværre var vi begrænset til kun to prøver, som regel anvendes denne type analyse mere, mindst 3-10 i det mindste på en eller anden måde relateret. Derfor er det nødvendigt at fortsætte forskningen med et stort antal prøver.
På samme tid kan vi sandsynligvis konkludere, at DNA-prøverne af Mary og Vavita svarer til humant DNA, men ikke falder sammen med det DNA, der er tilgængeligt for os fra en database med 1000 mennesker.
Forfattere af rapporten: Baranov V. S. og Aseev M. V. (Scientific Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Department of Prenatal Diagnostics), Glotov A. S. og Glotov O. S. (St. Petersburg State University), A. S. Komissarov (Institut for Cytologi, Det Russiske Videnskabelige Akademi, Center for genetisk bioinformatik).
Materialer leveret af Konstantin Georgievich Korotkov (doktor i tekniske videnskaber, professor, University of Information Technologies, Mechanics and Optics) og Dmitry Vladislavovich Galetsky (kandidat til medicinske videnskaber, I. P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University).
For mere om Nazca-mumier, se tagget: Nazca-mumier.
